wMel Wolbachia wechselt den weiblichen Posten

Aug 26, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 865 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der weltweit invasive Aedes aegypti verbreitet zahlreiche Arboviren, die Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben. Eine vielversprechende Methode zur Kontrolle von Ae. aegypti-Populationen handelt es sich um eine Transinfektion mit Wolbachia pipientis, die auf natürliche Weise etwa 40–52 % der Insekten infiziert, nicht jedoch Ae. Ägypter. Transinfektion von Ae. aegypti mit dem Stamm wMel Wolbachia induziert zytoplasmatische Inkompatibilität (CI), ermöglicht infizierten Individuen das Eindringen in einheimische Populationen und hemmt die Übertragung medizinisch relevanter Arboviren durch Frauen. Weibliche Insekten unterliegen nach der Paarung physiologischen Veränderungen und Verhaltensänderungen – die sogenannte weibliche Postpaarungsreaktion (PMR) –, die für eine optimale Fruchtbarkeit erforderlich sind. PMRs werden typischerweise durch männliche Samenflüssigkeitsproteine ​​(SFPs) ausgelöst, die während der Paarung mit den Spermien übertragen werden, können aber durch andere Faktoren, einschließlich der Zusammensetzung des Mikrobioms, verändert werden. Wolbachia hat mäßige Auswirkungen auf Ae. Aegypti-Fruchtbarkeit, sein Einfluss auf andere PMRs ist jedoch unbekannt. Hier zeigen wir, dass Wolbachia die Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit und Wiederpaarungshäufigkeit von Weibchen beeinflusst und die Lebenserwartung jungfräulicher Weibchen erheblich verlängert. Mithilfe proteomischer Methoden zur Untersuchung des Samenproteoms infizierter Männer stellten wir fest, dass Wolbachia die SFP-Zusammensetzung mäßig beeinflusst. Wir identifizierten jedoch 125 väterlich übertragene Wolbachia-Proteine, die CI-Faktor-Proteine ​​(Cifs) gehörten jedoch nicht dazu. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Wolbachia-Infektion von Ae. aegypti verändert weibliche PMRs und beeinflusst möglicherweise Kontrollprogramme, die mit Wolbachia infizierte Personen nutzen.

Aedes aegypti-Mücken sind eine weltweit invasive Art, die große Teile der Tropen und Subtropen erfolgreich besiedelt hat1,2. Aedes aegypti neigt dazu, städtische Umgebungen zu besiedeln3,4, und Weibchen dieser Art bevorzugen menschliche Wirte5,6, Faktoren, die die Übertragung von durch diese Art verbreiteten Viren erleichtert haben, zu denen Denguefieber7, Zika8, Chikungunya9 und Gelbfieber gehören Viren10. Das bewohnbare Gebiet von Ae. Es wird vorhergesagt, dass sich Aegypti mit steigenden globalen Temperaturen2,11 und zunehmender Urbanisierung6,12 ausbreiten wird, sodass die Bekämpfung dieser Art unerlässlich ist, um ihre Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit abzumildern.

Bemühungen, Ae zu kontrollieren. Aegypti haben sich in der Vergangenheit auf den Einsatz von Insektiziden verlassen. Die erhöhte Insektizidresistenz von Ae. Aegypti-Populationen haben die Wirksamkeit der chemischen Bekämpfung verringert13, was die Entwicklung neuartiger Bekämpfungsmethoden erforderlich macht. Eine vielversprechende Methode ist die Transinfektion von Ae. aegypti mit dem obligat intrazellulären Bakterium Wolbachia pipientis, einem Symbionten, der auf natürliche Weise 40–52 % der Insektenarten infiziert14,15, nicht jedoch Ae. Ägypter. Wolbachia wird mütterlicherseits vererbt und induziert bei transinfizierten Ae eine zytoplasmatische Inkompatibilität (CI). aegypti16,17, ein Phänomen, bei dem nicht infizierte Weibchen, die sich mit infizierten Männchen paaren, keine lebensfähigen Nachkommen hervorbringen, während infizierte Weibchen unabhängig vom Infektionsstatus ihrer Partner lebensfähige, mit Wolbachia infizierte Nachkommen hervorbringen. Die Induktion von CI ermöglicht infizierte Ae. aegypti verbreiten sich schnell in nicht infizierte Populationen16,17,18, wo sie langfristig stabil bleiben19. Eine Wolbachia-Infektion unterdrückt auch die Übertragung von Arboviren durch Ae. Aegypti-Weibchen, einschließlich DENV, ZIKV und CHIKV17,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29.

Angesichts der Tatsache, dass mit Wolbachia infizierte Ae. Aegypti sind in der Lage, sich schnell in Mückenpopulationen auszubreiten, während Wolbachia-infizierte Populationen – deren Fähigkeit, Krankheiten zu übertragen – beeinträchtigt sind, einheimische Populationen effektiv ersetzen können, wenn infizierte Männchen und Weibchen in die Umwelt freigesetzt werden30. Alternativ kann die kontinuierliche Freisetzung von Wolbachia-infizierten Männchen die einheimischen Mückenpopulationen durch die Etablierung von CI reduzieren31,32. Bevölkerungsersatzprogramme mit Ae. Aegypti, die mit dem aus Drosophila melanogaster isolierten Stamm wMel Wolbachia infiziert sind, wurden in mehreren Gebieten initiiert, in denen eine DENV-Übertragung stattfindet33,34,35,36, unter anderem in Medellín, Kolumbien37. Die erfolgreiche Etablierung infizierter Populationen hängt von einem minimalen Einfluss von Wolbachia auf die Reproduktionsparameter freigesetzter Ae ab. Aegypti Erwachsene. Es wurde berichtet, dass wMel Wolbachia keine oder nur mäßige Auswirkungen auf Ae hat. Aegypti-Fruchtbarkeit39, aber wie Wolbachia andere Fortpflanzungsprozesse in Ae verändern könnte. Aegypti wurde nicht erforscht.

Die Paarung löst bei weiblichen Insekten physiologische und Verhaltensänderungen aus, die die Produktion von Nachkommen erleichtern40,41. Weibliche Ae. Zu den Post-Paarungsreaktionen (PMRs) von Aegypti gehören eine Hemmung der erneuten Paarung42, eine erhöhte Lebenserwartung der Weibchen43, erhöhte Eiablageraten43 und Veränderungen der Genexpression im weiblichen Fortpflanzungsgewebe44,45,46. Die Haupteffektoren der Ae. Bei den weiblichen PMR von aegypti handelt es sich um Samenflüssigkeitsproteine ​​(SFPs), die während der Paarung zusammen mit den Spermien in den weiblichen Fortpflanzungstrakt übertragen werden. Weibliche PMRs bei Insekten werden auch durch andere Faktoren beeinflusst, wie etwa das Alter des Mannes49, die Ernährung des Erwachsenen50 und die Zusammensetzung des Mikrobioms des Erwachsenen51,52. Es wurde gezeigt, dass wMel Wolbachia die weiblichen PMRs in D. melanogaster verändert53, was auf die beobachtete Veränderung der SFP-Zusammensetzung bei infizierten Männern zurückzuführen sein könnte54. Eine Wolbachia-Infektion verändert jedoch die Proteinsekretion aus den weiblichen Spermienspeicherorganen von D. melanogaster54, die Gene exprimieren, die für den Eisprung, die Eiablage, die Spermienmotilität und die Spermienspeicherung wesentlich sind55,56. Somit könnte eine Wolbachia-Infektion möglicherweise die weibliche Ae beeinflussen. aegypti verändert sich nach der Paarung geschlechtsspezifisch.

In der vorliegenden Studie haben wir untersucht, wie wMel Wolbachia Ae beeinflusst. Aegypti weibliche PMRs. Wir sammelten wMel Wolbachia-infizierte Erwachsene, die in Medellín, Kolumbien, freigelassen wurden37 und kreuzten infizierte Weibchen sieben Generationen lang mit unserem Laborstamm zurück, um eine Wolbachia-infizierte Kolonie mit demselben genetischen Hintergrund zu erzeugen. Wir untersuchten, wie Wolbachia Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Wiederpaarungshäufigkeit und weibliche Langlebigkeit beeinflusst. Obwohl eine Wolbachia-Infektion keinen Einfluss auf die Spermienübertragung während der Paarung oder die Lagerung von Spermien durch begattete Ae hatte. Aegypti-Weibchen, Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit und Wiederpaarungshäufigkeit wurden beeinträchtigt. Darüber hinaus war die Lebenserwartung von Frauen bei Wolbachia-positiven Ae verändert. Aegypti-Weibchen unabhängig von der Paarung. Wir verwendeten proteomische Methoden, um die SFP-Spiegel zu untersuchen, die von Wolbachia-infizierten Männern auf Frauen übertragen wurden, und stellten fest, dass Wolbachia einen mäßigen Einfluss auf die SFP-Zusammensetzung hat. Unsere Proteomanalyse ermöglichte es uns auch, Wolbachia-Proteine ​​zu identifizieren, die während der Paarung väterlicherseits auf die Weibchen übertragen wurden. Obwohl 125 Wolbachia-Proteine ​​identifiziert wurden, ergab unsere Analyse zu unserer Überraschung nicht das Vorhandensein der CI-Faktor-Proteine ​​(Cif), die Spermien modifizieren, um CI57 zu etablieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Vorkommen von Wolbachia in Ae. Aegypti verändert die Fruchtbarkeit von Erwachsenen und beeinflusst das Verhalten und die Physiologie von Weibchen nach der Paarung. Die hier berichteten Auswirkungen haben potenzielle Auswirkungen auf Bevölkerungsersatzprogramme30,58 und Bevölkerungsunterdrückungsprogramme31,32, die mit Wolbachia infizierte Ae verwenden. aegypti, um Mückenpopulationen zu kontrollieren oder die Übertragung von Krankheiten zu unterdrücken.

Um die Auswirkungen einer Wolbachia-Infektion auf die Ae zu untersuchen. Aegypti weibliches PMR, wir sammelten wMel Wolbachia-infizierte Individuen aus dem Feld37 und kreuzten sie mit dem Thai-Stamm59 Ae zurück. aegypti, wodurch der ThaiWolb-Stamm entsteht. Wir untersuchten den möglichen Einfluss von Wolbachia auf die Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit weiblicher Ae. aegypti, as wMel Wolbachia hat mäßige geschlechtsspezifische Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit dieser Art38,39. Angesichts der Tatsache, dass die weibliche Größe die Fruchtbarkeit beeinflusst, untersuchten wir zunächst die Größe der in unseren Tests verwendeten Thai- und ThaiWolb-Erwachsenen und stellten fest, dass Thai- und ThaiWolb-Erwachsene bei der Aufzucht unter den gleichen Bedingungen eine ähnliche Größe hatten (ergänzende Abbildung 1). Um mögliche männliche oder weibliche spezifische Auswirkungen einer Wolbachia-Infektion auf Fruchtbarkeitsparameter zu beurteilen, führten wir unsere Tests in allen Paarungskombinationen durch (dargestellt als Weibchen x Männchen): Thai x Thai (Kontrolle), Thai x ThaiWolb, ThaiWolb x Thai, ThaiWolb x ThaiWolb.

Wir fanden signifikante Unterschiede in der Fruchtbarkeit zwischen den verschiedenen Paarungskombinationen (DF = 3, F = 17,78, p <0,0001; Abb. 1a). Wir konnten keinen Einfluss einer männlichen Infektion auf die weibliche Fruchtbarkeit feststellen, da thailändische Weibchen bei der Paarung mit thailändischen oder ThaiWolb-Männchen eine ähnliche Menge an Eiern legten (p = 0,95; Abb. 1a). Allerdings legten ThaiWolb-Weibchen bei der Paarung mit Thai-Männchen deutlich weniger Eier als Thai-Weibchen (p = 0,007; Abb. 1a) und erlitten bei der Paarung mit ThaiWolb-Männchen eine weitere Verringerung der Fruchtbarkeit (p < 0,0001; Abb. 1a). Ebenso war die Fruchtbarkeit (dargestellt als Schlupfprozentsatz) zwischen allen Paarungskombinationen signifikant unterschiedlich (DF = 3, F = 146,19, p < 2,2e-16; Abb. 1b). Die Fruchtbarkeit von ThaiWolb-Weibchen, die mit thailändischen Männchen gepaart wurden, war im Vergleich zu Kontrollpaarungen signifikant verringert (p < 0,0001; Abb. 1b), wobei die stärkste Unterdrückung der Fruchtbarkeit beobachtet wurde, wenn beide Geschlechter infiziert waren (p < 0,0001; Abb. 1b). Wie erwartet beobachteten wir aufgrund der Etablierung von CI eine signifikante Verringerung der Fruchtbarkeit bei der Paarung thailändischer Weibchen mit ThaiWolb-Männchen (p < 0,0001; Abb. 1b).

Fruchtbarkeit (a) und Schlupfprozentsatz (b) für jede Paarungskombination. Mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnete Gruppen unterscheiden sich bei einem Post-hoc-Tukey-Test deutlich (p < 0,05). Bei den Boxplots stellt die mittlere horizontale Linie den Median dar, der untere und obere Rand der Box stellen das 25. und 75. Quartil dar und die Whiskers erstrecken sich bis zum Minimum und Maximum der Daten (mit Ausnahme von Ausreißern, dargestellt als Punkte außerhalb der Whiskers). ).

Als nächstes untersuchten wir, ob eine Wolbachia-Infektion die Fähigkeit eines Männchens beeinträchtigt, die erneute Paarung seiner Partner zu verhindern. In unseren Tests paarten sich 27 % der thailändischen Weibchen erneut, als sie zum ersten Mal mit thailändischen Männchen gepaart wurden (Tabelle 1), ähnlich wie in früheren Berichten über diesen Stamm42,49. Bei der Paarung mit ThaiWolb-Männchen beobachteten wir jedoch einen signifikanten Anstieg der Wiederpaarungshäufigkeit (χ2 = 4,5, DF = 1, p = 0,03; Tabelle 1). ThaiWolb-Weibchen paarten sich bei der ersten Paarung mit einem ThaiWolb-Männchen auch deutlich häufiger erneut als bei der ersten Paarung mit einem thailändischen Männchen (χ2 = 3,2, DF = 1, p = 0,04; Tabelle 1). Angesichts der Zunahme der Wiederpaarungshäufigkeit, die nach der ersten Paarung mit ThaiWolb-Männchen beobachtet wurde, haben wir als Nächstes untersucht, ob dieser Effekt bei der Paarung mit Weibchen eines anderen Stamms erkennbar ist. Wir haben Thai- und ThaiWolb-Männchen mit Ae verpaart. aegypti, gesammelt in Akazien, Kolumbien61 und an Weibchen des Rockefeller-Stamms. Bei beiden Stämmen beobachteten wir einen ähnlichen Trend: Weibchen, die ursprünglich mit ThaiWolb-Männchen gepaart waren, paarten sich häufiger erneut als diejenigen, die ursprünglich mit Thai-Männchen gepaart waren, obwohl der Effekt in jedem Fall nicht signifikant war (Akazien: χ2 = 1,3, DF = 1). , p = 0,3; Rockefeller: χ2 = 0,5, DF = 1, p = 0,5; Tabelle 1). Obwohl ThaiWolb-Männchen eine erneute Paarung durch thailändische Weibchen kurz nach einer ersten Paarung weniger verhindern konnten, induzierten sie bei ihren Partnern innerhalb von 24 Stunden eine vollständige Feuerfestigkeit, und die Feuerfestigkeit blieb nach einer ersten Paarung 7 Tage lang bestehen (Ergänzungstabelle 1), wenn ein signifikanter Wert festgestellt wurde Anteil der thailändischen Weibchen paaren sich erneut, wenn sie während der Paarung nicht genügend SFP erhalten60.

Mehrfach verpaarter thailändischer Stamm Ae. Aegypti-Weibchen produzieren gemischte Nachkommen, indem sie die Spermien der ersten und zweiten sich paarenden Männchen verwenden, obwohl sie den Vorrang des ersten Männchens aufweisen49. Dies deutet darauf hin, dass Weibchen, die ursprünglich mit einem Wolbachia-infizierten Männchen gepaart wurden, bei erneuter Befruchtung durch ein zweites, nicht infiziertes Männchen lebensfähige Nachkommen hervorbringen. Wir haben in unseren Tests Eier ausgebrütet, die von wiederbefruchteten Weibchen gelegt wurden, um festzustellen, ob sie lebensfähige Nachkommen hervorbrachten. Thai-, Akazien- und Rockefeller-Weibchen, die ursprünglich mit einem ThaiWolb-Männchen gepaart waren, erzeugten jeweils lebensfähige Nachkommen, wenn sie sich anschließend erneut mit einem nicht infizierten Männchen paarten, obwohl die weibliche Fruchtbarkeit im Vergleich zu Weibchen, die ursprünglich mit einem Thai-Männchen gepaart waren, deutlich verringert war (ergänzende Abbildung 2).

Da wMel Wolbachia die weibliche Lebensdauer in D. melanogaster62 und in wMel-transinfizierten männlichen Ae erhöht. albopictus63, wir fragten, ob eine Wolbachia-Infektion Ae verändert. Aegypti-Lebensdauer. Gepaarter Ae. Aegypti-Weibchen haben eine deutlich längere Lebensspanne als Jungfrauen43,64, ein Effekt des SFP-Empfangs43. Wir untersuchten Paarungen zwischen infizierten und nicht infizierten Individuen und stellten fest, dass verpaarte thailändische Weibchen deutlich länger lebten als Jungfrauen (p = 4e-08; Abb. 2a), wie bereits berichtet43. Die Lebensdauer von jungfräulichen und begatteten ThaiWolb-Weibchen unterschied sich jedoch nicht signifikant (p = 0,2; Abb. 2a), und die Lebenserwartung von jungfräulichen ThaiWolb-Weibchen war signifikant länger als die von jungfräulichen Thai-Weibchen (p = 2e-12; Abb. 2a). Der beobachtete Anstieg der Lebenserwartung betraf spezifisch Frauen, da eine Wolbachia-Infektion keinen Einfluss auf die Lebenserwartung von Männern hatte (p = 0,86; ergänzende Abbildung 3). Da die Ernährung des Wirts die Auswirkungen von Wolbachia auf die Lebensdauer des Wirts verändern kann65, haben wir gefragt, ob die Ernährung erwachsener Tiere die Lebenserwartung der jungfräulichen ThaiWolb-Weibchen beeinflusst. Wir untersuchten die Lebenserwartung jungfräulicher Weibchen mit Zugang zu 10 % oder 2 % Saccharose. Wir fanden heraus, dass thailändische (p = 9,895e-07) und jungfräuliche ThaiWolb-Weibchen (p = 5,065e-08) mit 10 % Saccharose signifikant länger lebten als mit 2 % Saccharose (Abb. 2b). Allerdings lebten die jungfräulichen ThaiWolb-Weibchen bei jeder Diät deutlich länger als die Thai-Weibchen (10 % Saccharose: p = 0,0003; 2 % Saccharose: p = 1,64e-05; Abb. 2b).

a Langlebigkeit von Jungfrauen und Weibchen, die mit Männchen aus derselben Kolonie gepaart wurden (NT x T = 98, NW x W = 93, NvT = 94, NvW = 100). b Lebenserwartung jungfräulicher Weibchen mit Zugang zu 10 % oder 2 % Zucker als Erwachsene (NvT2 % = 84, NvT10 = 97, NvW2 = 68, NvW10 = 79). T = Thai, W = ThaiWolb, vT = Virgin Thai, vW = Virgin ThaiWolb.

Wolbachia beeinflusst die Spermienproduktion66 und die von D. simulans-Männchen übertragene Spermienmenge67, was die Möglichkeit erhöht, dass eine Wolbachia-Infektion die Spermienproduktion und/oder den Spermientransfer durch ThaiWolb-Männchen beeinflusst, was sich auf die Menge der von Weibchen gespeicherten Spermien auswirken würde68. Wir konnten jedoch keine Unterschiede in der Spermienmenge in den männlichen Samenbläschen – den Organen, die reife Spermien im männlichen Fortpflanzungstrakt speichern69 – zwischen ThaiWolb-Männern und thailändischen Männern feststellen (DF = 1, F = 0,752, p = 0,39). ; Abb. 3a), ähnlich den Ergebnissen für Ae. aegypti infiziert mit dem pathogenen Wolbachia-Stamm wMelPop39. Die von ThaiWolb-Männchen während der Paarung übertragene Spermienmenge unterschied sich ebenfalls nicht von der nicht infizierter thailändischer Männchen (DF = 3, F = 0,418, p = 0,741; Abb. 3b). Schließlich haben wir die Menge an Spermien ermittelt, die Weibchen in ihren Spermatheken, den Langzeitspeicherorganen für Spermien, gespeichert haben70. Die Spermienmenge in den Spermatheken war bei den Spermatheken von Thai- und ThaiWolb-Weibchen 24 Stunden nach der Befruchtung ähnlich (DF = 3, F = 2,039, p = 0,114; Abb. 3c). Somit scheint eine Wolbachia-Infektion keinen Einfluss auf die Spermienproduktion, den Spermientransfer während der Paarung oder die weibliche Spermienspeicherung zu haben.

Spermienmengen in der Samenblase jungfräulicher Männchen (a), die während der Paarung in den Schleimbeutel des weiblichen Fortpflanzungstrakts übertragen werden (b) und in den Spermatheken begatteter Weibchen gespeichert werden (c). Bei den Boxplots stellt die mittlere horizontale Linie den Median dar, der untere und obere Rand der Box stellen das 25. und 75. Quartil dar und die Whiskers erstrecken sich bis zum Minimum und Maximum der Daten (mit Ausnahme von Ausreißern, dargestellt als Punkte außerhalb der Whiskers). ).

wMel Wolbachia verändert die Expression von Genen, die für SFPs53 kodieren, und verändert die SFP-Zusammensetzung in natürlich infizierten D. melanogaster-Männchen54. Angesichts der Tatsache, dass ThaiWolb-Männchen bei der Verhinderung nachfolgender Kopulationen durch ihre Partner nicht optimal sind (Tabelle 1) und die Hemmung der erneuten Paarung durch den SFP-Empfang vermittelt wird, fragten wir, ob sich die SFP-Zusammensetzung bei mit Wolbachia infizierten Männern von der bei nicht infizierten Männern unterscheidet. Um Samenproteine ​​zu identifizieren, verwendeten wir einen proteomischen Ansatz, der die Identifizierung männlicher Proteine ​​ermöglicht, die während der Paarung auf Weibchen übertragen wurden71,72. Mit dem natürlichen Isotop 15N markierte Weibchen wurden mit unmarkierten, normal aufgezogenen Thai- und ThaiWolb-Männchen gepaart, und unmittelbar nach der Befruchtung aus den Schleimbeuteln isolierte Samenproteine ​​wurden durch Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) identifiziert und ihre Häufigkeit quantifiziert (siehe „Methoden“) “). Um zwischen Spermienproteinen und SFPs zu unterscheiden, verwendeten wir die Ae. Aegypti-Sperma und SFP-Proteom, berichtet in Lit. 72.

Wir fanden heraus, dass eine Wolbachia-Infektion einen mäßigen Einfluss auf die Zusammensetzung der während der Paarung übertragenen Samenproteine ​​hatte, da ThaiWolb- und Thai-Männchen-Ejakulate ähnliche Mengen an SFPs, Spermienproteinen und Spermien/SFP-überlappenden Proteinen aufwiesen (d. h. Proteine, die sowohl in den Spermien als auch in den Spermien identifiziert wurden). SFP-Proteome, aber häufiger im Ejakulat als im Sperma72) (Abb. 4a–d). Allerdings war ein Samenprotein bei thailändischen Männern deutlich häufiger anzutreffen als bei Thaiwolb-Männchen: das SFP-Trypsin-7 (AAEL006429) (Abb. 4b). Darüber hinaus wurde, obwohl statistisch nicht signifikant, festgestellt, dass drei zusätzliche Samenproteine ​​in thailändischen männlichen Ejakulaten mehr als viermal häufiger vorkommen als bei ThaiWolb-Männern: das Spermienprotein AAEL024468 (Abb. 4c) und zwei nicht klassifizierte Proteine, AAEL006115 und AAEL003365 (Abb. 4a); Sowohl AAEL006115 als auch AAEL003365 werden im Ae coexprimiert. Aegypti-Hoden und männliche Nebendrüse72. Schließlich identifizierten wir Samenproteine, die nur in männlichen Ejakulaten von Thai oder ThaiWolb nachgewiesen wurden, in anderen jedoch nicht (Ergänzungstabelle 2).

Vulkandiagramme, die die Häufigkeit aller in Thai- und ThaiWolb-Ejakulaten identifizierten Proteine ​​(a), als SFPs klassifizierte Samenproteine ​​(b), Spermienproteine ​​(c) und Spermien/SFP-überlappende Proteine ​​(d) zeigen. Werte unter Null stellen Proteine ​​mit höherer Häufigkeit in männlichen ThaiWolb-Ejakulaten dar, und Werte über Null stellen Proteine ​​mit höherer Häufigkeit in männlichen ThaiWolb-Ejakulaten dar.

Unsere proteomische Markierungsmethode ermöglichte es uns auch, Wolbachia-Proteine ​​zu identifizieren, die in der Samenflüssigkeit vorhanden sind und während der Paarung auf die Weibchen übertragen werden. Wir identifizierten 125 wMel Wolbachia-Proteine ​​in allen Replikaten, die in männlichen ThaiWolb-Ejakulaten vorhanden waren (Ergänzungsdaten 1). Allerdings wurden in allen Replikaten nur 20 dieser Proteine ​​konsistent nachgewiesen (Tabelle 2). Väterlich übertragene wMel-Wolbachia-Proteine ​​fielen in mehrere Funktionskategorien (Supplementary Data 1), und die Analyse der Genontologie (GO) zeigte eine Anreicherung von ATP- und Nukleotid-bindenden Proteinen, P-Loop-haltigen Triphosphathydrolasen und Translokasen (Supplementary Abb. 4). Unsere Analyse identifizierte keine Cif-Proteine, die CI in einem transgenen System rekapitulieren73. Wir haben jedoch Proteine ​​identifiziert, die den CI-Phänotyp modifizieren können74 (Ergänzungstabelle 3), darunter WD0462, ein vorhergesagtes Wolbachia-Effektormolekül75. Mehrere väterlich übertragene Wolbachia-Proteine ​​​​leiten sich von Phagen-WO-Sequenzen ab, die in das Wolbachia-Genom integriert sind, oder von WO-ähnlichen Inseln, die mit dem Phagen WO76 assoziiert sind und/oder von diesem abgeleitet sind (Ergänzungstabelle 3). Darüber hinaus haben wir übertragene Phagen-WO-Proteine ​​entdeckt, die mit dem Eukaryotic Association Module (Ergänzungstabelle 3) assoziiert sind, einer Region des Phagengenoms, die Gene enthält, die für Proteine ​​mit eukaryontischen Domänen kodieren und voraussichtlich mit dem Wirt interagieren77.

Wolbachia ist ein häufiger Insektensymbiont, der die Physiologie und das Verhalten des Wirts verändern kann. Da Wolbachia die Fortpflanzungsergebnisse verändert, was seine Ausbreitung begünstigt, wird es als Instrument zur Reduzierung der Vektorkompetenz von Ae eingesetzt. Aegypti-Weibchen58 und bietet eine Alternative zum fortgesetzten Einsatz von Insektiziden und/oder der Freisetzung gentechnisch veränderter Mücken. Kontrollprogramme führen derzeit groß angelegte Freilassungen von Wolbachia-infizierten Männern durch, um Vektorpopulationen31,32 oder beide Geschlechter in Populationsersatzprogrammen30,58 zu unterdrücken. Der Erfolg dieser Programme hängt davon ab, dass Wolbachia nur minimale Auswirkungen auf infizierte Individuen hat, damit sich freigelassene, mit Wolbachia infizierte Männchen erfolgreich mit einheimischen Weibchen paaren können, oder dass freigelassene, mit Wolbachia infizierte Erwachsene in Populationen eindringen können, die als Ersatz dienen sollen. Während Studien die Auswirkungen einer wMel-Wolbachia-Infektion auf Ae untersucht haben. Aegypti-Fruchtbarkeit26,38,39, keine Studien haben berichtet, wie Wolbachia andere weibliche Reaktionen nach der Paarung bei diesem wichtigen Krankheitsüberträger beeinflusst.

Die Auswirkungen einer wMel-Wolbachia-Infektion auf einige weibliche PMRs wurden bei Drosophila dokumentiert, die Auswirkungen von Wolbachia auf die weiblichen PMR bei transinfizierten Arten werden jedoch erst langsam untersucht. Wir fanden heraus, dass wMel Wolbachia Ae veränderte. weibliche Aegypti-PMRs ähnelten in mancher Hinsicht natürlich infizierten Drosophila und transinfizierten Insekten, unterschieden sich jedoch in anderen (Tabelle 3). Der genetische Hintergrund der Drosophila78 und die Aufzuchtbedingungen62 beeinflussen jeweils die Auswirkungen einer Wolbachia-Infektion auf den Wirt, was darauf hindeutet, dass ähnliche Auswirkungen bei transinfizierten Personen beobachtet werden. wMel-transinfiziertes Ae. aegypti zeigen eine Unterdrückung der Fruchtbarkeit, wenn beide Geschlechter infiziert sind, haben aber auch Auswirkungen festgestellt, wenn nur ein Geschlecht infiziert ist (Tabelle 3). Wir haben keine Auswirkung einer männlichen Infektion beobachtet, aber festgestellt, dass Wolbachia die Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit von Ae verringert. aegypti-Weibchen, unabhängig vom Infektionsstatus ihrer Partner, und wird nach der Paarung mit einem infizierten Männchen weiter unterdrückt. Paarung44,45,46, SFPs47 und Bluternährung45 verändern jeweils die Genexpression im Ae. aegypti weiblichen Fortpflanzungstrakt, einschließlich der Gene, die von den weiblichen Spermienspeicherorganen exprimiert werden45,46, deren Produkte für die Fruchtbarkeit unerlässlich sind46,55,79. Obwohl Wolbachia die Proteinproduktion aus den Spermienspeicherorganen bei Drosophila verändert54, ist nicht bekannt, ob ein ähnlicher Effekt bei Ae auftritt. aegypti, was für die beobachtete Verringerung der Fruchtbarkeit verantwortlich sein könnte.

wMel Wolbachia hatte einen paarungsunabhängigen Effekt auf Ae. aegypti weiblich, aber nicht männlich, Lebenserwartung. Bei wMel-infizierten Weibchen gab es keinen Anstieg der Lebenserwartung der Weibchen nach der Paarung, die Lebenserwartung der jungfräulichen ThaiWolb-Weibchen war jedoch deutlich erhöht. Wolbachia erhöht die Lebenserwartung anderer Insekten, einschließlich wMel-transinfizierter männlicher Ae. albopictus63 und D. melanogaster, letzteres abhängig vom untersuchten Drosophila-Stamm78. Die Fitnesskosten oder Vorteile einer Wolbachia-Infektion unterscheiden sich häufig zwischen den Studien, möglicherweise aufgrund unterschiedlicher Aufzuchtbedingungen oder des genetischen Hintergrunds des Wirts. Die Gründe für die erhöhte Lebenserwartung von Aedes sind unklar. Die Insulinsignalisierung ist bei einer Reihe von Organismen mit der Lebensdauer verbunden80, einschließlich D. melanogaster, wo eine erhöhte Insulinsignalisierung die Lebensdauer begatteter Weibchen verkürzt81. In Ae. Aegypti, insulinähnliche Peptide (ILPs), sind mit der Veränderung der weiblichen Lebensspanne verbunden, wobei eine Verringerung der ILPs die Lebenserwartung von Frauen erhöht82. Weitere Analysen sind erforderlich, um festzustellen, wie Wolbachia mit der Insulinsignalisierung oder anderen Signalwegen interagieren könnte, um die weibliche Lebensdauer bei Ae zu modulieren. Ägypter.

Wir beobachteten auch, dass mit Wolbachia infizierte Männchen die erneute Paarung ihrer Partner weniger erfolgreich verhindern konnten als ihre nicht infizierten Artgenossen. Die Unterdrückung der erneuten Paarung ist ein zentraler Aspekt. Aegypti weibliches PMR. Die Wahrscheinlichkeit einer erneuten Paarung ist innerhalb der ersten 2 Stunden nach einer ersten Paarung am höchsten42, nimmt jedoch mit zunehmender Zeit ab – die Weibchen sind etwa 20 Stunden nach einer ersten Paarung vollständig resistent42 und paaren sich nach dieser Zeit nicht mehr42,48. Unsere Tests könnten die Häufigkeit von Neupaarungen unterschätzen, da eine kürzlich durchgeführte Studie mit Mikrosatellitenmarkern zur Zuordnung der Abstammung ergab, dass Ae. Aegypti-Weibchen paaren sich mit bis zu vier Partnern83. Angesichts der Tatsache, dass der SFP-Empfang die Häufigkeit der erneuten Paarung von Weibchen beeinflusst48 und dass wMel Wolbachia die SFP-Zusammensetzung bei natürlich infizierten D. melanogaster-Männchen verändert54, stellten wir die Hypothese auf, dass Wolbachia die SFP-Zusammensetzung in Ae verändert. Ägypter. Die SFP-Quantifizierung ergab moderate Veränderungen in der SFP-Zusammensetzung bei dieser Art. Unsere Analyse hat jedoch möglicherweise keine proteolytisch gespaltenen SFPs identifiziert. Die Proteolyse von SFPs kommt häufig vor84 und ist oft für die SFP-Funktion erforderlich oder verbessert sie85,86,87. Die Spaltung von SFPs erfolgt beim Transport zum weiblichen Fortpflanzungstrakt oder kurz nach der Ablagerung im weiblichen Fortpflanzungstrakt87. Die Identifizierung proteolytisch gespaltener SFPs mit bioinformatischen Methoden ist ohne Kenntnis der entstehenden Spaltprodukte schwierig. Darüber hinaus kann die posttranslationale Modifikation von SFPs, die für ihre ordnungsgemäße Funktion erforderlich sein kann88, bei mit Wolbachia infizierten Männern abnormal sein. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um herauszufinden, warum mit Wolbachia infizierte Männchen die erneute Paarung ihrer Partner weniger verhindern können.

Eine Wolbachia-Infektion veränderte weder die im männlichen Fortpflanzungstrakt nachgewiesene Spermienmenge noch die während der Paarung übertragene Spermienmenge, was darauf hindeutet, dass die Spermienproduktion in den Hoden durch Wolbachia nicht gestört wird. Ein Aspekt, den wir nicht untersucht haben, ist, ob Wolbachia die Spermienqualität beeinträchtigen könnte, da die Spermienfunktion durch Modifikationen durch Wolbachia-Cif-Proteine ​​während der Spermatogenese57 oder durch einen möglichen Anstieg reaktiver Sauerstoffspezies, die in den Hoden von mit Wolbachia infizierten Drosophila auftreten, beeinträchtigt werden kann89 ,90. Die Konkurrenzfähigkeit der Spermien ist bei mit Wolbachia infizierten D. simulans-Männchen verringert91, was darauf hindeutet, dass eine intrinsische Eigenschaft der Spermien durch Wolbachia beeinträchtigt sein könnte. Eigenschaften wie Länge und Schwimmgeschwindigkeit beeinflussen die Ergebnisse der Spermienkonkurrenz bei mehrfach verpaarten Weibchen92. Die Konkurrenzfähigkeit von Spermien aus Wolbachia-infizierten Ae. Aegypti-Männchen müssen weiter untersucht werden, um möglicherweise subtile Defekte in der Spermienfähigkeit zu erkennen, die in unseren Tests nicht erkannt wurden.

Unser proteomisches Experiment identifizierte 125 Wolbachia-Proteine, die während der Paarung väterlicherseits übertragen werden. Obwohl die wMel-Proteine, die für die CI-Etablierung verantwortlich sind, bekannt sind57,73, ist der molekulare Mechanismus für das Phänomen noch nicht vollständig aufgeklärt. Für die Etablierung von CI wurden zwei Modelle vorgeschlagen: Wirtsmodifikation und Toxin-Gegenmittel. Das Wirtsmodifikationsmodell legt nahe, dass Cif-Proteine ​​Spermien modifizieren, Modifikationen, die von infizierten Weibchen wiederhergestellt werden. Das Toxin-Gegenmittel-Modell legt nahe, dass Cifs über Spermien zum Weibchen transportiert werden, aber durch einen bei infizierten Weibchen vorhandenen Rettungsfaktor gehemmt werden, der die Cifs bindet und ihre Toxizität hemmt93. Wir konnten im Ejakulat von mit Wolbachia infizierten Männern keine Cif-Proteine ​​nachweisen, was das Wirtsmodifikationsmodell stützt. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass die Cif-Proteinhäufigkeit bei künstlich infizierten Ae gering sein könnte. aegypti, wurden verändert und/oder begannen sich zu verschlechtern, wodurch unsere Erkennungsfähigkeiten eingeschränkt wurden. CifA und CifB wurden in reifen Spermien von mit wMel infizierten D. melanogaster57 nachgewiesen, während CidB in reifen Spermien von Culex-Männchen nachgewiesen wurde, die auf natürliche Weise mit wPip94 infiziert waren. Angesichts dessen, dass Ae. Aegypti künstlich mit Wolbachia infiziert werden, weisen Cif-Proteine ​​möglicherweise nicht die gleichen Eigenschaften auf, die bei natürlich infizierten Insekten beobachtet werden. Es wäre interessant, die Lokalisierungsmuster von wMel CifA und CifB in sich entwickelnden und reifen Ae zu untersuchen. aegypti-Spermien, um festzustellen, ob sie sich ähnlich verhalten wie bei natürlich infizierten D. melanogaster57.

Für den Erfolg von Programmen, die mit Wolbachia infizierte Personen nutzen, um einheimische Ae zu unterdrücken oder zu ersetzen. Aegypti-Populationen ist es wichtig zu verstehen, wie Wolbachia mit den Fortpflanzungsprozessen von Ae interagiert. aegypti, einschließlich der Induktion weiblicher PMRs. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Wolbachia einige weibliche PMRs verändert, wobei die verminderte Fähigkeit des Mannes, weitere Kopulationen zu verhindern, möglicherweise die Effizienz von Programmen zur Populationsunterdrückung oder die erfolgreiche Etablierung befreiter Erwachsener erschwert, wenn versucht wird, die Population zu ersetzen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, ob die Auswirkungen von wMel Wolbachia auf weibliche PMRs auch bei Ae beobachtet werden. Aegypti, transinfiziert mit anderen Wolbachia-Stämmen, die bei Kontrollbemühungen verwendet wurden95, und um die molekularen Wege zu bestimmen, die durch eine Wolbachia-Infektion beeinflusst werden, um das Verhalten und die Physiologie nach der Paarung bei weiblichen Ae zu verändern. Ägypter.

Thai59, DsRed96, Acacias61 und Rockefeller61 Stamm Ae. Aegypti wurden in unseren Tests verwendet. Der Akazienstamm von Ae. aegypti hat sich bereits als äußerst resistent gegen Pyrethroid-Insektizide erwiesen, während der Rockefeller-Stamm sehr anfällig ist61. DsRed-Mücken enthalten ein Transgen, das Spermien mit dem rot fluoreszierenden Protein DsRed (Aaβ2t::DsRed)96 markiert. Mückeneier wurden 30 Minuten lang unter Vakuum (–50 kPa) ausgebrütet. Die Larven wurden mit einer Dichte von 200/L in H2O vom Typ II, ergänzt mit vier (7,2–8,2 mm) Hikari Gold Cichlid-Futterpellets (Hikari, Himeji, Japan), aufgezogen. Dieses Fütterungsschema bringt erwachsene Tiere mit ähnlicher Größe hervor49,60. 15N-markierte Weibchen wurden mit einer Hefeaufschlämmung aufgezogen (siehe unten). Die Puppen wurden in 5-ml-Röhrchen überführt, um die Jungfräulichkeit sicherzustellen, und die resultierenden erwachsenen Tiere wurden nach dem Schlüpfen in geschlechtsspezifische Käfige aufgeteilt. Larven und Erwachsene wurden in Inkubatoren bei 27 ° C, 70 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer Photoperiode von 12:12 Stunden gehalten. Erwachsene hatten Zugang zu 10 %iger Saccharose nach Belieben. In unseren Tests wurden vier bis sechs Tage alte Erwachsene verwendet, mit Ausnahme der 15N-markierten Weibchen, die im Alter von zwei Tagen gepaart wurden. Die Flügellängen wurden wie in Lit. gemessen. 97 zur Schätzung der individuellen Größe; Die Flügellängen der in unseren Tests verwendeten Mückenstämme sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

Wir haben Ae gesammelt. Aegypti, die mit dem wMel-Stamm von Wolbachia infiziert sind, werden in Medellín, Kolumbien, freigesetzt37 (wir haben die Erlaubnis zur Sammlung von Feldproben von der Secretaria de Salud de Medellín erhalten). Ovitfallen98 wurden in der Nähe von Aranjuez, Medellín platziert und wöchentlich Eiablagesubstrate gesammelt. Die Eier wurden ausgebrütet, indem eierlegende Substrate in Wasser getaucht wurden, und die Arten der schlüpfenden Erwachsenen wurden anhand morphologischer Merkmale identifiziert. Aedes aegypti-Erwachsene aus einzelnen Ovitraps durften sich paaren, und die DNA-Extraktion weiblicher Nachkommen wurde wie folgt durchgeführt: Die Individuen wurden in 50 μl STE (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) und 1 μl mazeriert Anschließend wurde Proteinase K (20 mg/ml; Invitrogen, Waltham, USA) zugegeben. Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 56 °C und anschließend 15 Minuten lang bei 95 °C inkubiert. Zur Bestätigung der Art mittels Ae wurde isolierte DNA verwendet. Aegypti-spezifische PCR-Primer99 (aegF 5' – CTC TGC GTT GGA TGA ATG AT – 3'; aegR 5' – ATA GCG TGG TAG CCG TAT G – 3') und zur Bestimmung des Wolbachia-Infektionsstatus unter Verwendung von Primern, die spezifisch für die IS5-Wiederholung sind element24 (IS5F 5′– GTA TCC AAC AGA TCT AAG C-3′; IS5R 5′– ATA ACC CTA CTC ATA GCT AG – 3′). Eine Wolbachia-positive Kolonie wurde gegründet und wir sequenzierten einen Teil des wsp-Gens unter Verwendung der in Lit. angegebenen Primer. 100 (81F – TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC; 691R – AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA) und verwendete das Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) unter https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast .cgi, um zu bestätigen, dass wMel der infizierende Wolbachia-Stamm war. Wolbachia-positive Weibchen wurden sieben Generationen lang mit Männchen des thailändischen Stamms rückgekreuzt, um einen mit Wolbachia infizierten Stamm im thailändischen genetischen Hintergrund zu erzeugen. Angesichts des Rückgangs der Wolbachia-Dichte in Eiern während der Lagerung101 haben wir jeden Monat Eier ausgebrütet, um unsere Kolonie aufrechtzuerhalten, und vor unseren Tests 30–40 Individuen mittels PCR getestet, um den Infektionsstatus sicherzustellen.

Männchen und Weibchen wurden in einem 8-L-Käfig im Verhältnis Männchen zu Weibchen von 1:1 massenverpaart (25 Weibchen pro Käfig); Obwohl sich ein Teil der Weibchen bei der Massenbegattung erneut paart, hat die Mehrfachbesamung keinen signifikanten Einfluss auf die Fruchtbarkeit49 oder die Gesamtmenge der gespeicherten Spermien68 bei Weibchen des thailändischen Stamms. Nach 24 Stunden wurden die Männchen entfernt und die Weibchen am Arm eines Freiwilligen mit Blut gefüttert. Die Bluternährung an Menschen wurde vom Comité de Bioética Sede de Investigación Universitaria (Universidad de Antioquia) genehmigt, und Freiwillige unterzeichneten eine Einverständniserklärung; Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Vier Tage nach der Blutfütterung wurden die Weibchen einzeln mit einem 13 × 4 cm großen Papiertuchstreifen und 6 ml Typ-II-H2O in konische 50-ml-Röhrchen abgesaugt. Der Streifen wurde nach 48 Stunden entfernt und die Eier wurden mit einem ZEISS Stemi 508-Stereomikroskop (ZEISS, Oberkochen, Deutschland) gezählt. Die Eier wurden teilweise getrocknet und bis zum Schlüpfen, das 5–7 Tage später erfolgte, in einem Brutschrank gelagert. Um die Eier auszubrüten, wurde der Papierstreifen in einen 40-ml-Becher gegeben, mit H2O vom Typ II gefüllt, mit einer Prise aktiver Hefe ergänzt und 30 Minuten lang unter Vakuum gesetzt. Die resultierenden Larven wurden 4–6 Tage später gezählt. Der Schlupfprozentsatz wurde als Larven/Anzahl der Eier berechnet; Weibchen, die keine Eier legten, wurden in der Analyse nicht berücksichtigt.

Die Weibchen wurden zunächst parallel mit Thai- oder ThaiWolb-Männchen gepaart und erhielten dann die Möglichkeit, sich erneut mit einem DsRed-Männchen zu paaren. Wir beobachteten die erste Paarung, indem wir ein einzelnes Männchen und ein Weibchen in einen 8-L-Käfig steckten, bis es zu einer Kopulation kam, definiert als Genitalverschränkung für ≥10 Sekunden59,60. Nach der Entkopplung wurden die Weibchen sofort in einen separaten 8-L-Käfig mit 25 DsRed-Männchen aspiriert, bis ein Männchen-Weibchen-Verhältnis von 1:1 erreicht war; Die zweite Paarungszeit dauerte 4 Stunden, danach wurden die Männchen entfernt. Die Weibchen wurden mit Blut gefüttert und 4 Tage nach der Blutfütterung in die Eiablagekammern gebracht und erhielten 2 Tage Zeit, um Eier zu legen. Nach der Eiablage wurden die Weibchen bei –80 °C eingefroren, bis mit der Sektion begonnen wurde, um mehrfach befruchtete Weibchen zu identifizieren; Eier, die von mehrfach begatteten Weibchen gelegt wurden, schlüpften wie zuvor beschrieben aus. Um die langfristige Feuerfestigkeit zu bestimmen, wurden die Weibchen wie oben beschrieben mit einem Thai- oder ThaiWolb-Männchen gepaart und anschließend 24 Stunden oder 7 Tage später mit DsRed-Männchen in einen Käfig gesetzt. Die Identifizierung mehrfach verpaarter Weibchen erfolgte durch Präparation des unteren Fortpflanzungstrakts in 1X PBS, um das Vorhandensein (erneut verpaart) oder Fehlen (nicht erneut verpaart) von DsRed-Spermien49,60 unter Verwendung eines Nikon Eclipse Ti-U-Fluoreszenzmikroskops (Nikon) festzustellen Instruments Inc., Tokio, Japan).

Um festzustellen, ob eine Wolbachia-Infektion die Spermienproduktion verändert, haben wir Spermien aus den Samenbläschen jungfräulicher Männchen quantifiziert, den Organen, in denen reife Spermien gespeichert sind, die während der Paarung auf Weibchen übertragen werden69. Um den gesamten Spermientransfer zu beurteilen, quantifizierten wir die Spermien aus dem Schleimbeutel (wo die Männchen ihr Ejakulat ablegen70) unmittelbar nach der Befruchtung. Um die Gesamtmenge der von begatteten Weibchen gespeicherten Spermien zu ermitteln, haben wir die Spermien aus den Spermatheken, den Langzeitspeicherorganen für Spermien68,70, 24 Stunden nach der Paarung quantifiziert. Paarungen zur Bestimmung des Spermientransfers wurden beobachtet, um sicherzustellen, dass die Weibchen nur einmal kopulierten, während Paarungen zur Bestimmung der Spermienmenge in den Spermatheken wie zuvor beschrieben durchgeführt wurden. Für unsere Tests wurden erwachsene Tiere aus derselben Brut verwendet, und die Paarungen wurden am selben Tag durchgeführt. Um den Spermientransfer zu quantifizieren, wurden die Weibchen unmittelbar nach der Entkopplung auf Trockeneis schockgefroren. Um die Spermathekalmenge zu quantifizieren, wurden die Weibchen gepaart und für 24 Stunden in den Inkubator gelegt. Erwachsene wurden bis zum Beginn der Sektionen bei –80 °C gelagert. Die Spermien wurden unter Verwendung eines modifizierten Protokolls isoliert, das in Lit. beschrieben ist. 102. Kurz gesagt: Gewebe wurden in 1X PBS präpariert, in eine 250 μL-Kammer mit 100 μL 1X PBS gegeben, mit Minutiae-Stiften aufgebrochen, um Spermien freizusetzen, und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Weitere 100 μl PBS wurden hinzugefügt und die Lösung erneut gemischt. Zehn 5-μl-Aliquots wurden auf einen Glasobjektträger gegeben und 5 Minuten lang bei 50 °C getrocknet. Die Spermien wurden in 70 % Ethanol fixiert und die Spermienkerne wurden mit Giemsa-Farbstoff (Merck, Kenilworth, USA) angefärbt. Die Spermien in jedem Tropfen wurden unter Hellfeldbeleuchtung bei 200-facher Vergrößerung gezählt. Diese Teilprobe wurde zur Berechnung der Gesamtmenge an Spermien68 verwendet.

Die Weibchen wurden, wie zuvor beschrieben, im Verhältnis 1:1 massenverpaart, und die Männchen wurden vor Beginn unserer Tests entfernt. Jungfräuliche und begattete Weibchen wurden in getrennte 8-L-Käfige (ca. 50 Individuen pro Käfig) gebracht und für die Dauer des Experiments im Brutkasten gehalten. Für jede Paarungskombination oder jedes jungfräuliche Weibchen wurden zwei biologische Replikate durchgeführt, wobei Individuen aus unabhängig geschlüpften Kohorten verwendet wurden. Die Zuckerlösung wurde wöchentlich ausgetauscht. Die toten Individuen wurden alle 3 Tage entfernt, bis alle Individuen verendet waren.

Um Unterschiede in den SFP-Mengen zu untersuchen, die von Thai- und ThaiWolb-Männchen auf Weibchen übertragen wurden, markierten wir Weibchen mit dem natürlichen Isotop schwerer Stickstoff71,72 (15N) und identifizierten von Männchen stammende Proteine, die bei der Paarung übertragen wurden, wie in Lit. 72. Kurz gesagt, Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae; LEVAPAN, Sabaneta, Kolumbien) wurde in 200 ml Minimalmedium beimpft – 20 g/L D-Glucose, 1,7 g/L Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und 5 g/L Ammoniumsulfat mit 15 N (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA) in sterilem Wasser – und 24 Stunden lang auf einem Schüttler bei 190 U/min und 30 °C inkubiert, wonach weitere 800 ml Minimalmedium hinzugefügt wurden. Hefe wurde inkubiert, bis eine Dichte von 109 Zellen/ml erreicht war. Die Hefe wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 8000 U/min und 4 °C geerntet. Das Pellet wurde mit H2O vom Typ II, H2O vom Typ I und schließlich mit 1X PBS gewaschen. Hefe wurde in 20 ml 1X PBS resuspendiert, um eine Aufschlämmung zur Fütterung der Mückenlarven zu erzeugen72. Die Aufschlämmung wurde bei 4 °C gelagert und kurz nach ihrer Herstellung verwendet.

Eier vom Thai-Stamm wurden wie zuvor beschrieben ausgebrütet, mit einer Dichte von 200/L aufgezogen und 5 Tage lang jeden Tag mit 1 ml Hefeaufschlämmung gefüttert. Wie frühere Experimente mit 15N-markiertem Ae. aegypti zeigte, dass die erste Kohorte flugunfähige Erwachsene hervorbrachte71. Die Larven wurden in 200 ml Aufzuchtwasser einer früheren Kohorte und 800 ml Typ-II-H2O71,72 gezüchtet. Die Puppen wurden in 5-ml-Röhrchen überführt und die resultierenden Erwachsenen wurden nach dem Schlüpfen nach Geschlecht in 8-l-Käfige aufgeteilt.

15N-markierte Weibchen wurden mit nicht markierten, normal aufgezogenen ThaiWolb- oder Thai-Männchen gepaart. Ein einzelnes Männchen und ein Weibchen wurden in einen 8-l-Käfig gesetzt, bis es zur Kopulation kam. Begattete Weibchen wurden unmittelbar nach dem Entkoppeln auf Trockeneis schockgefroren und bis zum Beginn der Präparation bei –80 °C gelagert. Schleimbeutel von Versuchstieren (verpaart mit ThaiWolb-Männchen) und Kontrollweibchen (verpaart mit thailändischen Männchen) wurden in 1X PBS mit Proteaseinhibitoren (cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail; Roche, Basel, Schweiz) präpariert. Zwanzig Schleimbeutel wurden von Kontroll- und Versuchsweibchen gesammelt (jeweils drei biologische Replikate). Nach der Sektion wurde jeder Probe ein gleiches Volumen 2X Laemmli-Puffer + 5 % β-Mercaptoethanol zugesetzt. Die Proteine ​​wurden durch 30-sekündige Ultraschallbehandlung mit einem Elmasonic S30H-Ultraschallgerät (Elam, Singhem, Deutschland), 15-minütiges Erhitzen auf 95 °C und erneute 30-sekündige Ultraschallbehandlung solubilisiert. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 10.000 × g und 4 °C zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen gegeben und bei –80 °C gelagert.

Solubilisierte Proben wurden durch 1D-SDS-PAGE getrennt, um sechs Fraktionen pro Probe zu erzeugen, mit Trypsin verdaut und durch LC-MS/MS auf einem Orbitrap Lumos-Massenspektrometer analysiert. Peptide wurden auf eine PepMap 100 C18-Vorsäule (5 µm Partikel, 100 Å Pore, 300 µm × 5 mm, Thermo Scientific) mit 10 µL/min für 3 Minuten mit 0,1 % Ameisensäure geladen. Die Peptide wurden auf einer Umkehrphasen-Nano-EASY-Spray-C18-Analysesäule (2 µm Partikel, 100 Å Poren, 75 µm × 500 mm; Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) mit einem Gradienten von 1,6 bis 32 % Acetonitril in 0,1 % aufgetrennt. Ameisensäure über 120 min bei einer Flussrate von 300 nL/min. Alle m/z-Werte der eluierenden Ionen (Bereich 375–1500 Da) wurden mit einer Auflösung von 120.000 gemessen. Dem MS1-Scan folgten datenabhängige MS2-Scans (3 s Zykluszeit), um die am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen bei 35 % NCE zu isolieren und zu fragmentieren. Fragmentionen wurden mit einer Auflösung von 15.000 gemessen. Ionen mit +1 oder nicht zugewiesener Ladung wurden von der Analyse ausgeschlossen, und der dynamische Ausschluss zuvor abgefragter Vorläuferionen betrug 70 s.

Rohe Spektraldaten wurden gegen die Ae durchsucht. Aegypti-Proteindatenbank (Assembly AaegL5.0), angehängt an die cRAP v1.0-Kontaminantendatenbank (thegpm.org), unter Verwendung des Standard-Workflows in PEAKS X+ (de novo + PEAKS DB; Bioinformatics Solutions Inc.). Spektraldaten aller sechs Proben (drei Kontrollproben mit Thai-Männchen und drei mit ThaiWolb-Männchen) wurden in einer kombinierten Analyse unter Verwendung der folgenden Suchparameter zusammengeführt: Massentoleranz von 15 ppm für Elternionen und 0,5 Da für Fragmentionen, Carbamidomethylierung (C) als feste Modifikation, Oxidation (M) und Desamidierung (NQ) als variable Modifikationen und bis zu drei fehlende tryptische Spaltungen. Peptididentifizierungen wurden basierend auf dem Decoy-Fusion-Ansatz auf eine Falscherkennungsrate (FDR) < 1 % gefiltert103. Proteinidentifikationen wurden auf einen −10lgP-Score ≥ 20 und mindestens eine eindeutige Peptidspektrum-Übereinstimmung (PSMs) gefiltert. Markierungsfreie quantitative Vergleiche basierten auf der relativen Häufigkeit von Peptidmerkmalen unter Verwendung des PEAKS Q-Moduls (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, Kanada). Zusätzlich wurden Rohspektren der drei Proben aus Paarungen mit ThaiWolb-Männchen direkt gegen Wolbachia pipientis wMel (UP000008215) durchsucht, was zu 45.120 PSMs und 125 Proteinen führte (Supplementary Data 1).

Für alle Analysen wurde die R-Statistiksoftware Version 3.6.1 in Verbindung mit R-Studio Version 1.2.1335 verwendet104. Die Anzahl der von jedem Weibchen gelegten Eier (Fruchtbarkeit), die Daten zur Samenbläschen- und Spermathekalspermienmenge wurden zunächst analysiert, um die Wahrscheinlichkeitsverteilung zu bestimmen, die zu den Daten passt, einschließlich normaler, negativer Binomial- und Poisson-Verteilungen. Das Akaike-Informationskriterium (AIC) wurde verwendet, um die am besten zu den Daten passende Verteilung zu vergleichen, wobei der niedrigste AIC-Wert der am besten angepassten Verteilung entspricht. Wir bewerteten auch, ob sich jede Wiederholung unserer Tests in den von uns untersuchten Merkmalen unterschied. Da keine signifikanten Unterschiede zwischen den Replikaten festgestellt wurden, wurden die Daten aus jedem Experiment kombiniert und die Replikate als Zufallsfaktor in den Modellen verwendet. Wir analysierten Fruchtbarkeit, Samenbläschen, Schleimbeutel und die Spermienmenge in der Spermathekale mithilfe eines linearen gemischten Modells (LMM), wobei die Paarungskombination als fester Faktor verwendet wurde. Für den Schlüpfprozentsatz wurde ein verallgemeinertes lineares gemischtes Modell (GLMM) mit einer Binomialverteilung und der Paarungskombination als festem Faktor verwendet.

Die Häufigkeit der erneuten Paarung wurde durch die Durchführung des Chi-Quadrat-Tests der Unabhängigkeit auf der Grundlage der Kontingenztabelle zweier Variablen – Wolbachia-Infektionsstatus und Paarungsstatus (erneut verpaart und nicht erneut verpaart) – unter Verwendung des R-Statistikpakets und des Chi-Q-Tests bewertet Funktion. Die Lebenserwartung von Erwachsenen wurde mithilfe einer Kaplan-Meier-Kurve analysiert, um die kumulative Überlebenswahrscheinlichkeit im Zeitverlauf zu veranschaulichen. Cox-Proportional-Hazards-Regressionen (PH) und Log-Rank-Tests wurden verwendet, um Unterschiede zwischen Paarungskombinationen zu bewerten. Die Flügelgrößen wurden mithilfe eines LMM analysiert, wobei die Flügelgröße die Antwortvariable, der Mückenstamm ein fester Faktor und die Replikation ein Zufallsfaktor im Modell war. R-Code, der dieses Manuskript unterstützt, wird auf Anfrage zur Verfügung gestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Daten zur Beurteilung der Fruchtbarkeit, der Reaktionen nach der Paarung und der Übertragung/Lagerung von Spermien sind in den Zusatzdaten 2 verfügbar. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository105 beim ProteomeXchange-Konsortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) hinterlegt mit Projektzugang PXD043965. Auf RNA-Sequenzierungsdaten von Degner et al.72 kann im Sequence Read Archive (SRA) unter der Zugangsnummer SRP158536 zugegriffen werden. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir danken den Mitgliedern des Avila-Labors für ihre Hilfe bei Paarungstests und der Datenerfassung, Sebastián Diaz für die Hilfe beim Aufbau unserer ursprünglichen Wolbachia-positiven Kolonie, David Andres Borrego Muñoz für die vorläufige statistische Analyse, Laura Harrington und Omar Triana für die Bereitstellung der verwendeten Mückenstämme unsere Experimente, Margarita Correa und Giovan F. Gómez für technische Ratschläge, Seth Bordenstein, Sarah Bordenstein und Rupinder Kaur für hilfreiche Diskussionen, Mike Deery und Renata Feret vom Cambridge Centre for Proteomics (https://proteomics.bio.cam.ac. uk/) für Unterstützung bei der Probenvorbereitung und Qualitätskontrolle und Ruta N Medellín für Laborunterstützung. Diese Arbeit wurde durch das COLCIENCIAS-, Universidad de Antioquia- und Max-Planck-Gesellschaft-Kooperationsstipendium 566-1-2014 (an FWA), das Minciencias-Stipendium 821-2019 (an CAP und FWA) und das National Science Foundation-Stipendium DEB 1655840 (an SD) unterstützt. .

Max-Planck-Tandemgruppe für Reproduktionsbiologie von Mücken, Universität Antioquia, Medellín, Kolumbien

Jessica Osorio, Sara Villa-Arias, Luis Felipe Ramírez-Sánchez, Luisa María Barrientos, Carolina Bedoya, Catalina Alfonso-Parra und Frank W. Avila

Kolumbianisches Institut für Tropenmedizin, CES-Universität, Sabaneta, Kolumbien

Sara Villa-Arias & Catalina Alfonso-Parra

CENICAÑA Zuckerrohr-Forschungszentrum, Valle del Cauca, Kolumbien

Carolina Camargo

Medizinische Entomologiegruppe, Universität Antioquia, Medellín, Kolumbien

Guillermo Rúa-Uribe

Zentrum für reproduktive Evolution, Syracuse University, Syracuse, USA

Steve Doris

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JO, FWA, CAP und SD konzipierten und gestalteten die Experimente; GRU sammelte mit Wolbachia infizierte Personen vom Feld; CB führte die genetische Rückkreuzung durch; JO führte die Fruchtbarkeits-, Fruchtbarkeits-, Langlebigkeits- und Empfänglichkeitstests durch; JO, FWA, LFRS und LB führten die Spermienquantifizierungstests durch; SVA-gekennzeichnetes weibliches Ae. aegypti mit 15N; FWA, CAP und SVA paarten 15N-markierte Weibchen mit unmarkierten Männchen, führten die Gewebesektionen durch und bereiteten Proteinextrakte für die Massenspektrometrie vor; JO, CC und SD analysierten die Daten; JO und CC bereiteten die Zahlen vor, FWA schrieb das Manuskript und alle Autoren überprüften und genehmigten das Manuskript.

Korrespondenz mit Catalina Alfonso-Parra oder Frank W. Avila.

FWA ist Mitglied des Redaktionsausschusses für Kommunikationsbiologie, war jedoch weder an der redaktionellen Überprüfung noch an der Entscheidung zur Veröffentlichung dieses Artikels beteiligt. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Communications Biology dankt Alberto Civetta, Perran Ross und Mischa Emery für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptverantwortliche Redakteure: Hannes Schuler und Tobias Goris. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Osorio, J., Villa-Arias, S., Camargo, C. et al. wMel Wolbachia verändert das weibliche Verhalten und die Physiologie nach der Paarung bei der Dengue-Überträgermücke Aedes aegypti. Commun Biol 6, 865 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05180-8

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Eingegangen: 14. März 2023

Angenommen: 25. Juli 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05180-8

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